Науково-експериментальне обгрунтування технології дот-імуноаналізу за бруцельозу та лейкозу великої рогатої худоби - Хоменко, Ярослав Васильович (НУБіП України, 2017)
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук зі спеціальності 16.00.03 «Ветеринарна мікробіологія, епізоотологія, інфекційні хвороби та імунологія». Національний університет біоресурсів і природо-користування України, Київ, 2017. Розроблено методологію отримання компонентів для діагностики шляхом постановки дот-імуноаналізу за бруцельозу та лейкозу великої рогатої худоби: удосконалено методику отримання ліпополісахариду антигену B. аbortus; обґрунтовано доцільність використання рекомбінантного антигену вірусу лейкозу великої рогатої худоби, що містить протеїни з молекулярними масами 24 та 51 kDa та визначено оптимальні їх концентрації в дот-імуноаналізі; оптимізовано методику (Hermanson G. T., 1996) кон’югації рекомбінантного білка G Streptococcus spр. із колоїдним золотом; розроблено технологію отримання кон’югату рекомбінантного білка G Streptococcus spp. із колоїдним вугіллям; обґрунтовано доцільність використання листового білого полістиролу (HIPS) і розроблено оригінальну методику крапельної сорбції на ньому бруцельозного та лейкозного антигенів. Оптимізовано умови постановки дот-імуноаналізу, зокрема визначено, що використання з метою розбавляння досліджуваних сироваток крові фосфатно-сольового буфера (рН 7,2–7,4), який містить 0,75 % желатини, 2,5 М сечовини і 0,01 % бензойної кислоти повністю усуває можливість неспецифічної взаємодії компонентів дот-імуноаналізу. Розроблено експрес-методику диференціювання Br. аbortus та Yersinia Enterocolitica на базі дот-імуноаналізу. Доведено, що специфічність, чутливість та відтворюваність результатів дот-імуноаналізу за використання розроблених компонентів та оптимізованих умов постановки дот-імуноаналізу в процесі діагностики бруцельозу та лейкозу великої рогатої худоби відповідають вимогам Міжнародного епізоотичного бюро: специфічність і чутливість становлять 100 %, відтворюваність – задовольняє сучасні вимоги щодо тест-систем даного типу (CV<10 %)
Dissertation for the degree of candidate of veterinary sciences, speciality 16.00.03 «Veterinary Microbiology, Epizootiology, Infectious Diseases and Immunology». National University of Life and Environmental Sciences of Ukraine, Kyiv, 2017. Critical components for dot blot immunoassay for diagnosis of brucellosis and bovine leukemia were chosen, technology of production of chemical and biological components was developed: method for purification of B. аbortus LPS was improved; an expediency of using of the fusion recombinant protein, which includes both 24 kDa and 51 kDA proteins of bovine leucosis virus, was justified; optimal concentration of antigens in the dot blot immunoassay were determined; the protocol of G. T. Hermanson (1996) was optimized to bind colloidal gold nanoparticles to recombinant protein G Streptococcus spр.; the technology of conjugation of protein G Streptococcus spр. with carbon nanoparticles was developed; an expediency of using of High Impact Polystyrene (HIPS) was justified; original method of drip sorption for immobilization of B. аbortus and bovine leucosis virus antigens was developed. The protocol for dot blot immunoassay was optimized. In particular, it was determined that the use of phosphate-salt buffer (pH 7.2–7.4) containing 0.75 % gelatin, 2.5 M urea and 0.01 % benzoic acid as a serum diluent completely eliminates the nonspecific binding of dot blot immunoassay components. Dot blot immunoassay based express protocol for discrimination of Br. аbortus and Yersinia Enterocolitica was established. Sensitivity and specificity of developed test kits for diagnosis of brucellosis and bovine leucosis is 100 %, which is in conformity with World Organisation for Animal Health requirements. Coefficient of reproducibility for test kits is below 10 % (CV<10 %), which is right for such test kit. It has been proved that the specificity, sensitivity and reproducibility of developed dot blot immunoassay for diagnosis of brucellosis and bovine leukemia are in conformity with World Organisation for Animal Health requirements: specificity and sensitivity are 100 %, reproducibility satisfies modern requirements for such type of test kits (CV<10 %)
Keywords: бруцельоз; лейкоз великої рогатої худоби; діагностика; дот-імуноаналіз; колоїдне золото; колоїдне вугілля; brucellosis; bovine leukaemia; diagnostics