Детекція факторів патогенності у бактерій Salmonella SPP. в полімеразній ланцюговій реакції
Вантажиться...
Дата
2021
Автори
Назва журналу
Номер ISSN
Назва тому
Видавець
Анотація
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук за спеціальністю 16.00.03 «Ветеринарна мікробіологія, епізоотологія, інфекційні хвороби та імунологія». Національний університет біоресурсів і природокористування України. Київ, 2021. У дисертації вивчено розповсюдженість сальмонельозу птиці на території України впродовж 2006–2019 рр. Проаналізовано поширеність окремих сероварів у різних регіонах, а саме – збудників пулорозу й тифу, а також нетифоїдного сальмонельозу. Встановлено поступове зменшення поширеності сальмонел серед тварин та, відповідно, у зразках харчової продукції тваринного походження, що підлягають ветеринарно-санітарному контролю. Однак, з огляду на значну частку культур серовару Gallinarum та його біовару Pullorum, проблема пулорозу і тифу птиці залишається невирішеною. Окрім того, панівними залишаються серовари Enteritidis та Typhimurium, які спричиняють у дорослої птиці інфекцію з безсимптомним перебігом, що призводить до вертикальної передачі збудника, контамінації продукції птахівництва та ускладнення епізоотологічного контролю сальмонельозу. Методом полімеразної ланцюгової реакції проведено ідентифікацію генів, що кодують фактори патогенності: інвазія (invA), адгезія (agfB, sefA), ендотоксини (prt), колонізація (sopE, gipA, sodC1). Іденифіковано гени резистентності до тетрациклінів (tetG), сульфаніламідів (sulI) та інтегрон In104 – мобільний генетичний елемент, що у сальмонел локалізується на хромосомі. Інтегрон In104 містить функціональні елементи, які здійснюють реплікацію генів антибіотикорезистентності. Було визначено чутливість до антибактеріальних препаратів класу β-лактамів (амінопеніциліни: ампіцилін; цефалоспорини третього покоління: цефоперазон, цефтриаксон, цефтазидим), аміноглікозидів (гентаміцин, стрептоміцин), інгібіторів дигідрофолатредуктази (триметоприм), феніколів (хлорамфенікол) та хінолонів (налідиксова кислота, ципрофлоксацин). Проведено індукцію помірних бактеріофагів з використанням хіміотерапевтичного препарату Мітоміцин С. Розроблено набір праймерів для ідентифікації бактерій роду Salmonella та сероварів Enteritidis і Typhimurium
Опис
Thesis for a Candidate of Veterinary Science on specialty 16.00.03 «Veterinary Microbiology, Epizootiology, Infectious Diseases and Immunology». National University of Life and Environmental Sciences of Ukraine. Kyiv, 2021. The subject of this study is a prevalence of Salmonella spp. in Ukraine during 2006–2019. The prevalence of Salmonella serovars in different regions is analyzed, namely, the agents of fowl typhoid and Pullorum disease, as well as non-typhoid salmonellosis. In polymerase chain reaction we detected the genes encoding virulence factors: invasion (invA), adhesion (agfB, sefA), endotoxins (prt), colonization (sopE, gipA, sodC1). Also, genes conferring resistance to tetracyclines (tetG), sulfonamides (sulI) and class 1 integron In104 – a mobile genetic element that localizes on the chromosome, have been detected. The In104 integron contains functional elements that replicate antibiotic resistance genes. We determined susceptibility to antimicrobials of class β-lactams, aminoglycosides, dihydrofolate reductase inhibitors, phenicols, and quinolones. Induction of temperate bacteriophages was performed using the chemotherapeutic drug Mitomycin C. A set of primers was constructed to identify bacteria of the genus Salmonella and serovars Enteritidis and Typhimurium. The total number of 57 isolates of Salmonella were obtained from regional veterinary laboratories and isolated on poultry farms. Among the isolates, 22 belonged to Enteritidis serovar, 14 to Typhimurium serovar, 6 Gallinarum Pullorum, 4 Infantis, 3 Virchow, 2 Heidelberg, Hadar, Kentucky, and 4 Salmonella untypable cultures. Along with this, the object of the study was also strains of the genus Salmonella from the National Center of strains of the National Scientific and Control Institute of Biotechnology and Strains of microorganisms: S. Adabraka 1, S.Abortusovis 372, S. Typhimurium 371, S. Typhimurium 144, S. Typhimurium B,S.Typhimurium 3, S. Enteritidis P1, S. Enteritidis M, S. Gallinarum Pullorum K,S.Gallinarum Pullorum Stavropolsky, S. Gallinarum Pullorum Petelinsky,S.Gallinarum Pullorum 941, S. Choleraesuis 9, S. Choleraesuis 370, S. CholeraesuisTC-177, S. Dublin 373, S. Dublin K.The work was performed in 5 stages. The first stage was the analysis of the spread of Salmonella in Ukraine in 2006–2019 based on the results of laboratory studies of the State Institute of Laboratory Diagnostics and Veterinary and Sanitary Examination. In particular, we used data on the number of cases of salmonellosis in different areas from 2006 to 2019. The data analysis indicates a decrease in the spread of salmonella in Ukraine. Undoubtedly, a significant role in this is played by the implementation of the Program for the control and elimination of salmonellosis in poultry, which creates the conditions for much better epizootic control. of infection in farms. The second stage of the work was the development of sets of primers for the identification of bacteria of the genus Salmonella by polymerase chain reaction in real time. As a result of nucleotide sequence alignment and homology analysis, the following target genes were selected: invA for identification of the Salmonella genus, fliC for identification of Typhimurium serovar, gene for a hypothetical protein containing the DUF1391 domain for identification of serovar Enteritidis. Analytical sensitivity of the developed primer sets was: for S. Typhimurium – 0.25 ng/sample; for S. Enteritidis – 0.27 ng/sample. In the third stage of the work, the identification of genes of pathogenicity factors and factors that could increase the virulence of salmonella isolated from poultry and strains from the collection of the National Center of Strain strains of the State Scientific and Control Institute of Biotechnology and strains of microorganisms was carried out. The identification was performed by PCR method with agarose gel electrophoresis. Genetic material was found to contain 100 % of all the strains tested, providing the main stages of the infectious process, namely: the invA gene, which encodes an effector protein that invades the pathogen into the periplasmic space of a eukaryotic cell. The agfB gene encoding the fibrin protein subunit was detected in 100 % of the strains tested, providing adhesion factor. The sefA gene, which encodes a SEF14-type fibrin protein, that adheres to small intestinal wall cells has been identified. The sefA gene is specific for Enteritidis serovar. The presence of the prt gene was found to provide cell wall synthesis in serovars belonging to the D1 group according to the White-Kauffman Scheme. Genes of moderate bacteriophages encoding colonization factors were identified: gipA, sopE, sodC1. Replicons of plasmids of different types – pN, pFIA, pFIIA were detected. Tetracycline resistance gene – tetG, sulfonamide resistance gene – sul1 and integron In104, which is a mobile genetic element that provides the accumulation, transfer and replication of antibiotic resistance genes, have also been identified. The fourth stage of the work was to determine the sensitivity to antibacterial drugs. High resistance to quinolones in the field strain group was found: 71.93 % of resistant strains to nalidixic acid and 80.70 % to ciprofloclassin. The lowest resistance was set for trimethoprim – 28.07 % and streptomycin – 33.33 %. In the group of strains from the NSCSM collection, high sensitivity to all antibacterial drugs was established. Sensitivity was determined by disc diffusion with CLSI breakpoints. In the fifth stage of the study, the induction of moderate bacteriophages was performed using mitomycin C. The results of the studies were determined by the titer of induced bacteriophages phenotypically manifested by the lysis zone of Salmonella cultures on the surface of the solid nutrient medium. In the NSCSM strain group, the highest titer was 4×104, the lowest was 1×104. No lysis zones were detected in five strains (Typhimurium 141, Enteritidis M, Gallinarum Pullorum Stavropol, Choleraesuis TC-177, Dublin K). Among the isolates of S. Typhimurium, no lysis zones were detected in only four: S. Typhimurium 000173, S. Typhimurium 16, S. Typhimurium VM4, S. Typhimurium M1003
Ключові слова
сальмонела, штам, гени факторів вірулентності, антибіотикорезистентність
Бібліографічний опис
Детекція факторів патогенності у бактерій Salmonella SPP. в полімеразній ланцюговій реакції : автор. дис. ...кандидата ветеринарних наук: 16.00.03 "Ветеринарна мікробіологія, епізоотологія, інфекційні хвороби та імунологія" (ветеринарні науки) / Н.М. Рубленко ; Національний університет біоресурсів і природокористування України. - Київ, 2021. - 25 с